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　　三邻甲苯磷酸酯(TOCP)在小鼠成熟功能损伤中的作用及机制研究.pdf

　　目的邻苯三甲酸酯（TRIORTHOCRESYLPHOSPHATE，TOCP）作为一种较为常见的增塑剂，广泛地用于日常生活中，其生殖毒性也日益引起大家关注。已有研究显示，TOCP可损伤雄性生精功能，影响发生。然而其对成熟功能是否有影响尚未见报道。本课题通过慢性染毒模型和体外孵育方法观察TOCP对小鼠成熟功能的影响，并探索特异性离子通道CATSPER和SLO3在其中的作用。为揭示TOCP等增塑剂对雄性生殖系统损害的分子机制及为临床诊疗相关生殖疾病提供新思路与新方法。方法1、分别以不同剂量（0、100、200、400MG/KG/D）的TOCP灌胃建立慢性染毒小鼠模型。2、通过测量染毒小鼠睾丸系数、睾丸组织的HE染色以观察TOCP对小鼠睾丸组织的生殖毒性。3、分别采用0、025、05、1MMOL/L等不同浓度TOCP孵育小鼠1H后行体外相关实验。4、运用计算机辅助分析系统（CASA）观察慢性染毒与体外孵育的小鼠的活率、运动力情况。5、利用（CTC）金霉素染色法检测慢性染毒与体外孵育小鼠的自发性与P4诱发性顶体反应率的变化。6、采用免疫蛋白印迹方法（WESTERNBLOT）检测慢性染毒小鼠特异性钙通道CATSPER14和钾通道SLO3的蛋白表达水平变化。7、利用全细胞膜片钳技术记录慢性染毒与体外孵育下CATSPER和SLO3通道电流（ICATSPER和IKSPER）。结果1、HE染色结果显示，100MG/KG/DTOCP处理组的小鼠睾丸曲细精管无明显破坏，而200MG/KG/D和400MG/KG/DTOCP处理组小鼠睾丸的曲细精管结构显著紊乱，其生精细胞脱落，同时睾丸系数降低（P＜001P＜0001）。2、CASA结果显示，TOCP可显著抑制慢性染毒小鼠的存活率和运动力，并有浓度依赖性。同样，体外孵育1H后发现，TOCP在一定程度上抑制的活率与运动力（P＜005）。3、金霉素（CTC）染色结果表明，TOCP慢性染毒组的自发与P4诱发顶体反应发生率仅在400MG/KG/D组呈显著性差异（P＜005）。TOCP体外孵育05MMOL/L组不会影响自发顶体反应，但显著抑制P4诱发顶体反应率（P＜005）。1MMOL/L组则对自发和诱发顶体反应均有显著的抑制作用（P＜005）。4、免疫蛋白印迹（WESTERNBLOT）检测结果显示，随着TOCP染毒剂量的增加，CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3、SLO3蛋白表达呈显著下降，而CATSPER4蛋白表达仅在400MG/KG/D组呈表达差异。5、膜片钳电流检测结果显示，与对照组相比，TOCP染毒对小鼠ICATSPER呈剂量依赖式抑制（P＜0001），在400MG/KG/D组甚至未检测出相关电流变化；而TOCP对IKSPER亦呈浓度依赖式抑制（200MG/KG/D组P＜001；400MG/KG/D组钾电流为0）。体外孵育实验显示，TOCP对ICATSPER具有一定程度的抑制（1MMOL/L组P＜005），而对IKSPER无明显影响。结论1、增塑剂TOCP影响小鼠成熟生理功能。2、TOCP的功能损伤机制与特异性离子通道CATSPER与SLO3的抑制有关。

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